Ús i precaucions del tub de centrífuga d'ultrafiltració
1) Trieu un tub d'ultrafiltració adequat.Tingueu en compte que les membranes UF difereixen pel seu nivell de tolerància a diversos productes químics.Normalment, els tubs d'ultrafiltració amb un tall de pes molecular de 10 kDa es poden seleccionar amb un tall de pes molecular que no hauria de ser superior a 1/3 del pes molecular de la proteïna d'interès, com ara 35 kDa.Si el pes molecular de la proteïna d'interès és d'uns 10 kd, es pot utilitzar un tub d'ultrafiltració amb un tall de pes molecular de 3 kd.
(2) L'ultrafiltració, acabada de comprar, és seca, s'afegeix aigua ultrapura abans de l'ús i l'aigua passa completament per la membrana, el bany de gel o la nevera prèviament refredada durant uns minuts.Aleshores s'aboca l'aigua, és a dir, la proteïna líquida, i la quantitat que s'afegeix, la que no sigui més que la línia blanca de la part superior del tub.L'operació és lleugera i el tub d'ultrafiltració s'ha de refredar prèviament amb gel abans d'afegir la solució de proteïnes.
3) Tant la massa com el centre de gravetat havien d'arribar a l'equilibri.Tingueu en compte que la velocitat de rotació i l'acceleració no són molt ràpides, en cas contrari danyarà directament la membrana d'ultrafiltració.Es va iniciar la ultrafiltració centrífuga (centrífuga prerefridada a 4 graus).Després de convertir les RPM de diferents centrífugues a g, era diferent.L'acceleració de la centrífuga es va ajustar al mínim, reduint la pressió sobre la membrana.Tingueu en compte que assegureu-vos de deixar la centrífuga després que la centrífuga hagi arribat a la seva velocitat de destinació, o si teniu un problema, no podreu gestionar-lo per primera vegada.L'orientació de la membrana a l'eix es va ajustar segons les instruccions (la caixa angular de la centrífuga és perpendicular de membrana a eix).En l'ús pràctic, la velocitat de rotació general és inferior a la de les instruccions, de manera que es pot allargar la vida útil del tub de centrífuga.
3) Tant la massa com el centre de gravetat havien d'arribar a l'equilibri.Tingueu en compte que la velocitat de rotació i l'acceleració no són molt ràpides, en cas contrari danyarà directament la membrana d'ultrafiltració.Es va iniciar la ultrafiltració centrífuga (centrífuga prerefridada a 4 graus).Després de convertir les RPM de diferents centrífugues a g, era diferent.L'acceleració de la centrífuga es va ajustar al mínim, reduint la pressió sobre la membrana.Tingueu en compte que assegureu-vos de deixar la centrífuga després que la centrífuga hagi arribat a la seva velocitat de destinació, o si teniu un problema, no podreu gestionar-lo per primera vegada.L'orientació de la membrana a l'eix es va ajustar segons les instruccions (la caixa angular de la centrífuga és perpendicular de membrana a eix).En l'ús pràctic, la velocitat de rotació general és inferior a la de les instruccions, de manera que es pot allargar la vida útil del tub de centrífuga.
(4) Quan es concentra fins a l'1 ml restant, agafeu 50 ul de solució tampó, afegiu-hi 10 ul de flux i comproveu si hi ha algun color blau, com a judici de si al tub d'ultrafiltració li falta proteïna.Si el tub té fuites, torneu a abocar la capa superior i la travessa en un tub nou per iniciar la ultrafiltració.Per determinar amb precisió si s'han perdut tubs, centrifugueu durant 10 minuts amb 5 mg ml de BSA abans del flux, funcionant amb cola de proteïnes o assaig brut de Bradford, i continueu afegint la solució de proteïna concentrada restant (que funciona amb gel i evita que les proteïnes s'escalfin) fins que s'ha afegit tot el concentrat.Aneu amb compte durant la centrifugació si es produeix la precipitació de proteïnes, provocant el tancament del tub.Si es produeix una precipitació, determineu si la causa específica de la precipitació és una concentració excessiva de proteïnes o un tampó inadequat;El primer es pot resoldre mitjançant la ultrafiltració de múltiples tubs d'ultrafiltració simultàniament, disminuint la concentració, i el segon intercanviant diferents solucions tampó fins que no es produeixi la precipitació de la proteïna.
(4) Quan es concentra fins a l'1 ml restant, agafeu 50 ul de solució tampó, afegiu-hi 10 ul de flux i comproveu si hi ha algun color blau, com a judici de si al tub d'ultrafiltració li falta proteïna.Si el tub té fuites, torneu a abocar la capa superior i la travessa en un tub nou per iniciar la ultrafiltració.Per determinar amb precisió si s'han perdut tubs, centrifugueu durant 10 minuts amb 5 mg ml de BSA abans del flux, funcionant amb cola de proteïnes o assaig brut de Bradford, i continueu afegint la solució de proteïna concentrada restant (que funciona amb gel i evita que les proteïnes s'escalfin) fins que s'ha afegit tot el concentrat.Aneu amb compte durant la centrifugació si es produeix la precipitació de proteïnes, provocant el tancament del tub.Si es produeix una precipitació, determineu si la causa específica de la precipitació és una concentració excessiva de proteïnes o un tampó inadequat;El primer es pot resoldre mitjançant la ultrafiltració de múltiples tubs d'ultrafiltració simultàniament, disminuint la concentració, i el segon intercanviant diferents solucions tampó fins que no es produeixi la precipitació de la proteïna.
(5) Els primers passos s'utilitzen per concentrar la proteïna i, si s'ha de canviar el tampó, afegiu suaument un nou tampó (ultrafiltració a través d'una membrana d'ultrafiltració de 0,22 um) a aproximadament 1 ml de proteïna total i torneu a concentrar-lo a aproximadament 1 ml durant tres vegades consecutives, amb el volum final concentrat final depenent de la concentració de proteïnes desitjada, generalment no superior a 500 ul, però també a 200 ul.Aconseguiu 1000 × o més en tres ocasions, bàsicament el mateix canvi de tampó, calculat per almenys 10 × aproximadament un enriquiment de volum cada vegada.
(5) Els primers passos s'utilitzen per concentrar la proteïna i, si s'ha de canviar el tampó, afegiu suaument un nou tampó (ultrafiltració a través d'una membrana d'ultrafiltració de 0,22 um) a aproximadament 1 ml de proteïna total i torneu a concentrar-lo a aproximadament 1 ml durant tres vegades consecutives, amb el volum final concentrat final depenent de la concentració de proteïnes desitjada, generalment no superior a 500 ul, però també a 200 ul.Aconseguiu 1000 × o més en tres ocasions, bàsicament el mateix canvi de tampó, calculat per almenys 10 × aproximadament un enriquiment de volum cada vegada.
Hora de publicació: 09-nov-2022