PCR, és la reacció en cadena de la polimerasa, que es refereix a l'addició de dNTP, Mg2+, factors d'allargament i factors de millora de l'amplificació al sistema sota la catàlisi de l'ADN polimerasa, utilitzant l'ADN progenitor com a plantilla i cebadors específics com a punt de partida d'extensió , Mitjançant els passos de desnaturalització, recuit, extensió, etc., el procés de replicació in vitro d'ADN de cadena filla complementari a l'ADN de plantilla de cadena mare pot amplificar de manera ràpida i específica qualsevol ADN objectiu in vitro.
1. Hot Start PCR
L'hora d'inici de l'amplificació a la PCR convencional no és posar la màquina de PCR a la màquina de PCR i, a continuació, el programa comença a amplificar-se.Quan s'ha completat la configuració del sistema, comença l'amplificació, que pot provocar una amplificació inespecífica, i la PCR d'inici en calent pot resoldre aquest problema.
Què és la PCR d'inici en calent?Després de preparar el sistema de reacció, el modificador enzimàtic s'allibera a alta temperatura (generalment superior a 90 ° C) durant l'etapa d'escalfament inicial de la reacció o etapa d'"inici en calent", de manera que s'activa l'ADN polimerasa.El temps i la temperatura d'activació exactes depenen de la naturalesa de l'ADN polimerasa i del modificador d'arrencada en calent.Aquest mètode utilitza principalment modificadors com anticossos, lligands d'afinitat o modificadors químics per inhibir l'activitat de l'ADN polimerasa.Com que l'activitat de l'ADN polimerasa s'inhibeix a temperatura ambient, la tecnologia d'arrencada en calent ofereix una gran comoditat per preparar múltiples sistemes de reacció de PCR a temperatura ambient sense sacrificar l'especificitat de les reaccions de PCR.
2. RT-PCR
La RT-PCR (PCR de transcripció inversa) és una tècnica experimental per a la transcripció inversa de l'ARNm a l'ADNc i utilitzar-la com a plantilla per a l'amplificació.El procediment experimental consisteix a extreure primer l'ARN total en teixits o cèl·lules, utilitzar Oligo (dT) com a cebador, utilitzar la transcriptasa inversa per sintetitzar l'ADNc i després utilitzar l'ADNc com a plantilla per a l'amplificació per PCR per obtenir el gen objectiu o detectar l'expressió gènica.
3. PCR quantitativa fluorescent
PCR quantitativa fluorescent (PCR quantitativa en temps real,RT-qPCR) es refereix al mètode per afegir grups fluorescents al sistema de reacció de PCR, utilitzant l'acumulació de senyals fluorescents per controlar tot el procés de PCR en temps real i, finalment, utilitzar la corba estàndard per analitzar quantitativament la plantilla.Els mètodes qPCR utilitzats habitualment inclouen SYBR Green I i TaqMan.
4. PCR niuada
La PCR niuada fa referència a l'ús de dos conjunts d'encebadors de PCR per a dues rondes d'amplificació de PCR, i el producte d'amplificació de la segona ronda és el fragment del gen objectiu.
Si un desajust del primer parell d'encebadors (encebadors externs) fa que un producte inespecífic s'amplifiqui, la possibilitat que la mateixa regió inespecífica sigui reconeguda pel segon parell d'encebadors i continuï amplificant-se és molt petita, de manera que el l'amplificació mitjançant el segon parell d'encebadors, s'ha millorat l'especificitat de la PCR.Un dels avantatges de realitzar dues rondes de PCR és que ajuda a amplificar suficient producte a partir d'ADN inicial limitat.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR és un mètode per millorar l'especificitat de la reacció de PCR ajustant els paràmetres del cicle de PCR.
A la PCR de contacte, la temperatura de recuit dels primers cicles s'estableix uns graus per sobre de la temperatura màxima de recuit (Tm) dels primers.Una temperatura de recuit més alta pot reduir eficaçment l'amplificació inespecífica, però al mateix temps, una temperatura de recuit més alta agreujarà la separació d'encebadors i seqüències diana, donant lloc a un rendiment de PCR reduït.Per tant, en els primers cicles, la temperatura de recuit normalment s'estableix per disminuir 1 °C per cicle per augmentar el contingut del gen objectiu al sistema.Quan la temperatura de recuit es redueix a la temperatura òptima, la temperatura de recuit es manté durant els cicles restants.
6. PCR directa
La PCR directa es refereix a l'amplificació de l'ADN objectiu directament de la mostra sense necessitat d'aïllar i purificar àcids nucleics.
Hi ha dos tipus de PCR directa:
mètode directe: agafeu una petita quantitat de mostra i afegiu-la directament a PCR Master Mix per a la identificació de PCR;
Mètode de craqueig: després de mostrejar la mostra, afegiu-la al lisat, liseu per alliberar el genoma, preneu una petita quantitat de sobrenedant lisat i afegiu-lo a PCR Master Mix, realitzeu la identificació per PCR.Aquest enfocament simplifica el flux de treball experimental, redueix el temps de pràctica i evita la pèrdua d'ADN durant els passos de purificació.
7. SOE PCR
L'empalmament gènic per PCR d'extensió solapada (SOE PCR) utilitza cebadors amb extrems complementaris per fer que els productes de PCR formin cadenes superposades, de manera que en la reacció d'amplificació posterior, mitjançant l'extensió de les cadenes superposades, es superposen diferents fonts de tècnica A en què els fragments amplificats es superposen. i empalmats junts.Aquesta tecnologia té actualment dues direccions principals d'aplicació: construcció de gens de fusió;mutació dirigida al lloc del gen.
8. IPCR
La PCR inversa (IPCR) utilitza cebadors complementaris inversos per amplificar fragments d'ADN diferents dels dos cebadors, i amplifica seqüències desconegudes a banda i banda d'un fragment d'ADN conegut.
L'IPCR es va dissenyar originalment per determinar la seqüència de regions desconegudes adjacents, i s'utilitza principalment per estudiar seqüències promotores de gens;reordenaments cromosòmics oncogènics, com ara la fusió de gens, la translocació i la transposició;i la integració de gens virals, també s'utilitzen habitualment ara. Per a la mutagènesi dirigida al lloc, copieu un plasmidi amb la mutació desitjada.
9. dPCR
La PCR digital (dPCR) és una tècnica per a la quantificació absoluta de molècules d'àcid nucleic.
Actualment hi ha tres mètodes per quantificar les molècules d'àcid nucleic.La fotometria es basa en l'absorbància de les molècules d'àcid nucleic;La PCR quantitativa fluorescent en temps real (PCR en temps real) es basa en el valor Ct, i el valor Ct fa referència al número de cicle corresponent al valor de fluorescència que es pot detectar;La PCR digital és l'última tecnologia quantitativa basada en el mètode PCR d'una sola molècula per comptar la quantificació d'àcids nucleics és un mètode quantitatiu absolut.
Hora de publicació: 13-juny-2023